[email protected]
2019. augusztus 18

Antoniou és munkatársai nemrégiben publikáltak egy tanulmányt. félkövér címmel: “A glifozát nem helyettesíti a glicint az aktívan osztódó emlőssejtek fehérjéiben.” [1]. A tanulmányban az emberi mellráksejteket hat napig tették ki glifozát hatásának, majd a Tandem tömegcímke (TMT) jelölésnek nevezett kifinomult technikát alkalmazták a állítólagosan rendellenesen nehéz glicinmolekulákat tartalmazó rövid peptidek azonosítására. Mind a kezelt, mind a kezeletlen sejtekből származó fehérjéket szabványos protokollnak vetették alá, amely tömegspektrometriát, részleges proteolízist és további elemzést tartalmazott, amint azt a cikk részletezi.

A sejteket a Dulbecco’s Modified Eagle Medium nevű, gazdag tápanyag-összetételen tartották fenn. Ez a készítmény az eredeti Basal Medium Eagle módosítása, amely négyszeresen gazdag aminosavakban és vitaminokban. Magas glükózkoncentrációja is van, 4500 mg/L. Nincs garancia arra, hogy nem szennyezett glifozáttal. Ezenkívül a sejteket a múltban bizonyos ideig tenyészetben növesztették, és valószínűleg jelentős számú rosszul hajtogatott glifozáttal szennyezett fehérje halmozódott fel, amelyeket nehéz volt kitisztítani. Valószínűleg már glifozáttal szennyezett fehérjékkel kezdték meg életüket a tenyészetben, annak az embernek a glifozátnak való kitettsége révén, aki eredetileg emlődaganatban hordozta ezeket a sejteket.

A szerzők a mintákat két különböző poszttranszlációs módosításra (PTM) tesztelték: a glioxiláttal módosított ciszteinre és a glicin glifozát helyettesítésére. Belefoglalták a glioxilát módosítást, mert azt feltételezték, hogy a glifozát glioxilátra bomlik, amely képes kötődni a cisztein maradékokhoz. Nevezetesen, nem mutattak ki glioxiláttal módosított ciszteint sem a kontrollsejtekben, sem a kezelt sejtekben.

Ezzel szemben a szerzők jelentős jelet találtak a glifozát jelenlétére a kezelt minták több rövid peptidjében. Ugyanakkor a kezeletlen mintákban is ugyanolyan erős jelet találtak. Azt írták: “Ebben a kísérletben azonban a két feltételezett PTM (poszt-transzlációs módosítás) egyike sem várható el glifozátos kezelés hiányában. Így lehetséges volt a TMT címkézés segítségével azonosítani és kiszűrni potenciális hamis felfedezések.” És akkor: “Az adatok meggyőzően azt mutatják, hogy minden jelölt helyettesített peptid hamis felfedezés.”

Ugyanilyen elfogadható érv azonban az, hogy a “kezeletlen” sejtek is tartalmaznak glifozáttal helyettesített fehérjéket. Potenciálisan a legtöbb, ha nem az összes jelölt helyettesített peptid valódi felfedezés. Mivel a kezelt és a kontrollsejtek is hosszú ideig voltak kitéve glifozát hatásának, valószínű, hogy mindkettőben közel azonos mennyiségben halmozódtak fel glifozáttal szennyezett fehérjék. Anthony Samsel és én a glicin glifozáttal történő helyettesítéséről szóló első tanulmányunkban megvitattuk, hogy az N-szubsztituált glicinek olyan peptoidokat képezhetnek, amelyeket nagyon nehéz lebontani, és hogy a foszfonátokról kimutatták, hogy képesek gátolni a proteolízist [2].

Azt az elképzelést, hogy a glifozát expozíció proteolízisrezisztens fehérjék felhalmozódását eredményezi, alátámasztja egy 2013-ban borsónövényekről publikált tanulmány [3]. A szerzők megfigyelték az ubiquitinált fehérjék felhalmozódását a proteolízis enzimek fokozódásával együtt, ami meglepő és szokatlan. Írtak:

“Az ubiquitinált fehérjék felhalmozódását, valamint a megnövekedett feltételezett proteaszóma aktivitást az ABPP [Tevékenység alapú fehérjeprofil] segítségével figyelték meg, ami azt jelzi, hogy a proteaszóma szerepet játszik a herbicid kezelés során. Az ubiquitinált fehérjék felhalmozódását jellemzően a fehérje egyidejű csökkenésével összefüggésben írták le. Eredményeink mindazonáltal a proteaszóma szubsztrát szintjének és aktivitásának növekedését mutatták, így a herbicidek által kiváltott stressz a proteomon a megnövekedett proteaszóma aktivitás ellenére ubiquitinált fehérjék felhalmozódását eredményezheti, vagy a szubsztrát elérhetőségének növekedése proteaszóma aktivitást indukál.”

Valószínűleg az a magyarázat, hogy a fehérjékbe ágyazott glifozát megzavarja a proteolitikus enzimek azon képességét, hogy lebontsák azt. Valójában egy cikkben, amely a glifozátot az amiotróf laterális szklerózishoz (ALS) kapcsolja össze, leírtuk, hogy a glifozát hogyan zavarhatja meg magát az ubikvitinációs folyamatot, amely a proteaszóma által delécióra jelöli a fehérjéket [4]. Írtunk:

“A legérdekesebb az a tény, hogy maga az ubiquitin kritikusan egy erősen konzervált karboxi-terminális kettős glicin pártól függ, hogy létrejöjjön a komplex ubiquitin lánc, amely egy fehérje lebomlását jelzi [46] [itt reprodukálva [5]]. A glifozát helyettesítése bármelyikre ezek közül az esszenciális glicinek várhatóan rontják a hibásan hajtogatott fehérjék újrahasznosításának folyamatát. Ez könnyen megmagyarázhatja a rosszul hajtogatott fehérjék felhalmozódását, amely az ALS jellegzetes jellemzője.”

Szerencsére Antoniou et al. [1] a 3. táblázatukban megadták a kimutatott glifozátszubsztitúciós pontos szekvenciákat, az Uniprot webhely pedig egy olyan eszközt biztosít, ahol a BLAST nevű szoftvercsomag segítségével specifikus szekvenciákat tartalmazó fehérjéket találhat. Az Uniprot képes volt lekérni mind a 15 fehérje azonosságát, amelyek találatként szerepelnek a 3. ábrán, az egyes fehérjékben jelenlévő szekvenciák pontos egyezésével. Mind a 15 fehérje emberi fehérje volt. E fehérjék közül legalább kilenc kötődik foszfáttartalmú molekulákhoz, amint azt az 1. táblázat tartalmazza. Ez alátámasztja azt az elképzelést, hogy a foszfátot megkötő fehérjék különösen érzékenyek a glifozát szubsztitúcióra, amint azt Gunatilake és munkatársai nemrégiben publikálták. [6], mely szerint a glifozát a Srí Lanka-i mezőgazdasági dolgozók körében az ismeretlen etiológiájú krónikus vesebetegség (CKDu) fő tényezője. Valójában a növényekben a fehérje EPSP-szintáz, amelyről úgy gondolják, hogy a glifozát fő célpontja a gyomok elpusztításában, erősen konzervált glicin-maradékot tartalmaz azon a helyen, ahol a foszfoenol-piruvát (PEP) kötődik. A DowDupont kutatói a CRISPR technológiát felhasználva glifozáttal szemben rezisztens kukoricatörzset tudtak létrehozni az EPSP szintáz CRISPR-módosított génje miatt [7]. Az első lépés a DNS-kód megváltoztatása volt, hogy a PEP-kötőhelyen lévő glicint alaninnal cseréljék ki. Ennek eredményeként az enzimnek egy olyan változata jött létre, amely teljesen érzéketlen volt a glifozátra.

1. táblázat: Kilenc glifozáttal szubsztituált peptidet tartalmazó fehérje, Tandem tömegcímke (TMT) spektrometriai eszközökkel azonosítva. Ezeket a peptideket, valamint további 6 peptidet tenyészetben növesztett rákos sejtekben találtak. Mind a kilenc kötődik foszfátot tartalmazó molekulákhoz, amint azt a harmadik oszlopban jeleztük. Az első oszlop a kimutatott szekvenciát tartalmazza, ahol a „*” azt a glicin-maradékot jelöl, amelyről azt találtuk, hogy helyettesített. Lásd: Antoniou et al. (2019) a kísérleti beállítás részleteiért.

Összességében az 1. táblázat egy érdekes listát tár fel az emberi fehérjékről, amelyek közül sok várhatóan emlőráksejtekben expresszálódik. Például az egyik egy RNS-metilációs fehérje (tRNS (guanin(10)-N2)-metiltranszferáz homológ). Egy másiknak az Akt gátlása révén tumorszuppresszor funkciója van, a foszfatidil-inozitol-foszfátokhoz (Pleckstrin homológia domént tartalmazó 5. családtag) kötődik. Egy másik a G-protein-kapcsolt receptor (GPCR). Bar-Shavit és munkatársai szerint “a GPCR-ek a tumorgenezis számos jellemzőjét szabályozzák, beleértve az immunsejtek által közvetített funkciókat, a proliferációt, az inváziót és a túlélést a másodlagos helyen.” [8] Egy másik sláger a homeobox fehérje, és a fehérjéknek ez az osztálya kifejezetten ok-okozati szerepet játszik a mellrákban [9].

A cikk másik fontos felfedezése az a két fehérje, amelyekről kimutatták, hogy statisztikailag szignifikánsan megnőtt a hatnapos glifozát-kezelés hatására. Ezek a következők: ADP/ATP nukleotid transzlokáz (ANT) és szerin/argininben gazdag splicing factor 6 (SRSF6) [1]. Ez a két fehérje nagyon érdekesnek bizonyul, mert ismert, hogy mindkettő túlzottan expresszálódik a tumorsejtekben, és mindkét esetben e fehérjék magasabb szintje a rákos betegek rossz kimeneteléhez kapcsolódik.

Az SRSF6 a splicing faktorok családjának tagja, amelyek erőteljesen képesek megváltoztatni a fehérjeexpressziót azáltal, hogy módosítják a peptidek egyedi exonokból történő összeállítását. Az SRSF6 túlzott expressziója a tüdőhámsejtekben fokozta a proliferációt, megvédte őket a kemoterápiától, és növelte daganatképző képességüket [10]. Ezenkívül az SRSF6 leütése a tüdő- és vastagbélrák sejtvonalakban csökkentette azok tumorigén potenciálját. Az SRSF6 gyakran expresszálódik bőrrákban, és megváltoztatja a tenascin C nevű fehérje splicingjét, hogy elősegítse az invazív és metasztatikus rák kialakulását [11]. Az SRSF6 a keratinociták túlzott proliferációját is okozza, ami a pikkelysömör jellegzetes jellemzője [12]. Ha a glifozát az SRSF6 felszabályozását okozza az emlőráksejtekben, az valószínűleg fokozott daganatképződést okoz a kitett emberekben.

Az ANT számos különböző izoforma létezik, amelyek eltérő hatással vannak a sejtbiológiára, de az ANT2, amely erősen expresszálódik az emlőráksejtekben, az ANT2, és kimutatták, hogy fontos a tumor túlélése szempontjából. Az ANT2 feladata, hogy ATP-t szállítson a mitokondriumokba, és ez a tevékenység fontos, ha egy sejt a Warburg-effektus feltételezései szerint működik. A rákos sejtek nagy mennyiségű ATP-t termelnek a citoplazmában glikolízis révén, majd az ANT2 az ATP-t a mitokondriumokba szállítja, hogy csökkentsék az ATP-t, amelyet oxidatív foszforilációval kell termelniük. Ez egy jó stratégia az oxidatív károsodások elleni védekezésre, különösen akkor, ha a mitokondriumok működésképtelenné válhatnak a toxikus expozíció által okozott DNS-mutációk miatt. Az ANT2 valójában úgy programozza be a sejtet, hogy olyan stratégiákat hajtson végre, amelyek stresszorok jelenlétében apoptózis helyett fokozott proliferációhoz (sejthalálhoz) vezetnek [13]. Az utóbbi időben érdeklődés mutatkozott olyan gyógyszerek kifejlesztése iránt, amelyek az ANT2 aktivitás elnyomásával küzdenek a rák ellen [14].

Az Antoniou et al. A papír jelentős áttörést jelenthet a fehérjék glifozátszennyezésének kimutatására szolgáló eljárás kidolgozásában. Figyelemre méltó, hogy 15 emberi fehérjét sikerült azonosítaniuk, amelyek úgy tűnik, hogy glifozáttal módosítottak egy specifikus glicin-maradékot. A papír nagy értékű a közösség számára, mert olyan előírt eljárást ír elő, amely ma már meglehetősen rutinszerűen alkalmazható számos más, tenyészetben termesztett sejttípuson, valamint emlősök beteg szöveteiből, például körmökből kinyert biológiai mintákon. szklerodermás betegek bőrsejtjei, pikkelysömörben szenvedő betegek bőrsejtjei, autista gyermekek szőrmintái, alapító betegségben szenvedő lovak patái, tumorbiopsziák, Alzheimer plakk postmortem, beteg vese- és májszövetek stb.

A glifozáttal szennyezett fehérjék felfedezésének jövőbeli lehetőségei bővelkednek, és ahogy összegyűjtjük a specifikus szubsztitúciós minták adatbázisát, akár szabályokat is megjósolhatunk azokra a peptid-összefüggésekre, ahol a glicin-maradékok különösen érzékenyek, például amikor a szomszédos aminosavak kicsik (a megelőzés érdekében sztérikus gátlás) vagy pozitív töltésű (hogy a glifozátot a negatív töltése miatt vonzza a peptid összeállítás helyére). Valójában az ilyen típusú szabályok már nyilvánvalóvá válnak az Antoniou et al. kísérlet. A 15 feltételezett szubsztituált glicin közül hatot közvetlenül egy pozitív töltésű aminosav (lizin, hisztidin vagy arginin) követett. Tízet pedig közvetlenül megelőzött a valin, leucin, szerin vagy treonin egyike, amelyek mindegyike kis aminosav, és helyet biztosít a glifozát metil-foszfonil-farkának. Ha a glifozát valóban helyettesíti a glicint a fehérjeszintézis során, a következmények elgondolkodtatóak, és a glifozát alattomos kumulatív toxikus hatásai könnyen megmagyarázhatják az autoimmun, metabolikus, neurológiai és onkológiai betegségek hosszú listájának elterjedésének manapság tapasztalható növekedését.

Hivatkozások

[1] MN Antoniou et al. Glyphosate does not substitute for glycine in proteins of actively dividing mammalian cells. BMC Res Notes 2019; 12:494. (Web link)
[2] A Samsel and S Seneff. Glyphosate, pathways to modern diseases V: Amino acid analogue of glycine in diverse proteins. Journal of Biological Physics and Chemistry 2016; 16: 9-46. (Web link) (Letöltés)
[3] A Zulet et al. Proteolytic Pathways Induced by Herbicides That Inhibit Amino Acid Biosynthesis. PLoS ONE 2013; 8(9): e73847. (Web link)
[4] S Seneff et al. Does glyphosate acting as a glycine analogue contribute to ALS? J Bioinfo Proteomics Rev 2016: 2(3): 1-21. (Web link) (Letöltés)
[5] A Zuin et al. Ubiquitin signaling: Extreme conservation as a source of diversity. Cells 2014; 3(3): 690-701. (Web link)
[6] S Gunatilake et al. Glyphosate’s Synergistic Toxicity in Combination with Other Factors as a Cause of Chronic Kidney Disease of Unknown Origin. Int J Environ Res Public Health 2019; 16(15). pii: E2734. (Web link) (Letöltés)
[7] Y Dong et al. Desensitizing plant EPSP synthase to glyphosate: Optimized global sequence context accommodates a glycine-to-alanine change in the active site. J Biol Chem 2019; 294(2): 716-725. (Web link)
[8] R Bar-Shavit et al. G Protein-Coupled Receptors in Cancer. Int J Mol Sci 2016; 17(8). pii: E1320. (Web link)
[9] MT Lewis. Homeobox genes in mammary gland development and neoplasia. Breast Cancer Research 2000; 2: 159. (Web link)
[10] M Cohen-Eliav et al. The splicing factor SRSF6 is amplified and is an oncoprotein in lung and colon cancers. J Pathol 2013; 229(4): 630-9. (Web link)
[11] MA Jensen et al. Splicing factor SRSF6 promotes hyperplasia of sensitized skin. Nat Struct Mol Biol 2014; 21(2): 189197. (Web link)
[12] H Valdimarsson et al. Psoriasis: a disease of abnormal Keratinocyte proliferation induced by T lymphocytes. Immunol Today 1986; 7(9): 256-9. (Web link)
[13] SH Baik and J Lee. Adenine nucleotide translocase 2: an emerging player in cancer. J Stem Cell Res Med 2016; 1(2): 66-68. (Web link)
[14] J-Y Jang et al. Suppression of adenine nucleotide translocase-2 by vector-based siRNA in human breast cancer cells induces apoptosis and inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research 2008; 10(1): R11. (Web link)